obtención ácidos nucleicos

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purificación aaa

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Regina Romero

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obtención ácidos nucleicos


obtención ácidos nucleicosOnline version purificación aaa by Regina Romero 1 Etapas para obtención de ácidos nucleicos a Lisis celular, extracción, purificación, solubilización y evaluación b Extracción, purificación, solubilización c Lisis celular, purificación, cuantificación d Lisis celular, extracción, purificación 2 ¿Cómo se obtiene el material genético puro? a Por agotamiento b Por precipitación con solventes como isopropanol, después del salting out c Por agitación con solventes 3 La lisis celular se da con agentes a Promotores b Protectores, que garantizan la integridad de los ácidos nucleicos, impidiendo o limitando la acción de las DNAsas o RNAsas presentes en las células o contaminantes del medio. c Expositores, que garantizan la integridad del material genético 4 Procedimientos químicos de la lisis celular Escoge una o varias respuestas a Agentes que alteran la membrana citoplásmica; detergentes (CTAB, SDS), o sales caotrópicas (isotiocianato de guanidinio), solventes (fenol). b c Agentes que alteran membrana ribosómica; detergentes (CTAB, SDS), o sales caotrópicas (isotiocianato de guanidinio), solventes (fenol). d Agentes que alteran la pared celular; enzimas (lisozima, quitinasa, celulasa, proteinasa K) 5 Procedimientos físicos de la lisis celular Escoge una o varias respuestas a Shock térmico, varios ciclos rápidos de calentamiento / enfriamiento (90° / -30°C) b Shock térmico, solo un ciclo de calentamiento/enfriamiento (90°C- 0°C) c Shock osmótico, cambio rápido a soluciones con diferente osmolaridad d Ruptura mecánica con molienda con materiales abrasivos o agitación con perlas e Shock hidrolítico, cambio rápido a soluciones con más agua 6 Extracción de ácidos nucleicos Escoge una o varias respuestas a extracciones sucesivas con agua b extracciones sucesivas con fenol, fenol:cloroformo, fenol:cloroformo:alcohol isoamílico c Salting out: Comúnmente se utiliza NaCl, K-Acetato o NH4 -acetato. Los ácido nucléicos quedan en el sobrenadante orgánico d Salting out: Comúnmente se utiliza NaCl, K-Acetato o NH4 -acetato. Los ácido nucléicos quedan en el sobrenadante acuoso e Unión selectiva del DNA o RNA a soportes sólidos (columnas de sílica, matriz con oligo dT unido) 7 Los ácidos nucleicos son a Polares por su grupo fosfato b Apolares por su grupo nitro c Polares por su grupo nitro d Apolares por su grupo fosfato 8 Las proteínas en solución Escoge una o varias respuestas a Orgánica: poseen residuos no polares que se encuentran en el interior de la proteína b Acuosa: poseen residuos no polares que se encuentran en el interior de la proteína c Acuosa: residuos pasan hacia el exterior (desnaturalización), volviéndose más solubles en la fase orgánica. d Orgánica: residuos pasan hacia el exterior (desnaturalización), volviéndose más solubles en la fase orgánica. 9 Las sales en salting out a las sales no se asocian pero si precipitan los ácidos nucleicos b las sales se asocian con los grupos cargados de las proteínas, pero no se deshidratan ni precipitan los ácidos nucleicos c las sales se asocian con los grupos cargados de las proteínas, éstas se deshidratan, pierden solubilidad y precipitan. d las sales no se asocian con los grupos cargados 10 Los ácidos nucléicos se unen a la sílica en presencia de a concentraciones altas de sales caotrópicas (ej. cloruro de guanidinio). b concentraciones bajas de sales caotrópicas (ej. cloruro de guanosino) c concentraciones bajas de sales caotrópicas (ej. cloruro de guanidinio) d concentraciones altas de sales caotrópicas (ej. cloruro de guanosino) 11 Unión selectiva de DNA o RNA a soportes sólidos Escoge una o varias respuestas a Oligonucleótidos que se unen a las cabezas de poliA de los RNAm de eucariotas. b El DNA/RNAse eluye de la membrana utilizando buffers de baja fuerza iónica c Oligonucleótidos que se unen a las colas de poliA de los RNAm de eucariotas. d El RNAm puro se eluye de la columna con H2O o buffer de alta fuerza iónica. e El RNAm puro se eluye de la columna con H2O o buffer de baja fuerza iónica. 12 La precipitación del DNA/RNA es más eficiente... a a bajas temperaturas y altas concentraciones de ácidos nucleicos b a altas temperaturas y bajas concentraciones de ácidos nucleicos c a bajas temperaturas y bajas concentraciones de ácidos nucleicos d a bajas temperaturas 13 Solubilización y evaluación de DNA Escoge una o varias respuestas a El EDTA quela a los iones Mg2+ ayudando a mantener a las RNAsas inactivas. b El DNA se puede conservar a 4°C. Por períodos prolongados es preferible hacerlo a -10°C o -40°C . c almacenar el DNA en un buffer ligeramente básico (TE [10mM], pH 8.0) para evitar la despurinización y la acción de las DNAsas. d El EDTA quela a los iones Mg2+ ayudando a mantener a las DNAsas inactivas. e El DNA se puede conservar a 4°C. Por períodos prolongados es preferible hacerlo a -20°C o -80°C . 14 Solubilización y evaluación de RNA Escoge una o varias respuestas a Almacenar a -20°C en alícuotas de un solo uso, por períodos cortos y por períodos prolongados a -40°C. b Requiere buffers neutros o ligeramente ácidos (pH 6-7). c agua libre de DNAsas d agua libre de RNAsas e Almacenar a -20°C en alícuotas de un solo uso, por períodos cortos y por períodos prolongados a -80°C. 15 Pureza e integridad Escoge una o varias respuestas a DNAdc de buena pureza tiene una relación A260/A280 entre 1.6 y 1.9 b RNASS de buena pureza tiene una relación A260/A280 de 2 c RNASS de buena pureza tiene una relación A260/A280 de 1 d DNAdc de buena pureza tiene una relación A260/A280 entre 1 y 1.5 16 Visualización DNA Escoge una o varias respuestas a DNA genómico fragmentado, de bajo peso molecular, obtenido con lisis física fuerte (bead-beating). Debido al procedimiento se obtuvo un “barrido de DNA”, el tamaño de los fragmentos es <2000pb, conforme a las dos bandas inferiores del marcador b DNA genómico fragmentado sin distinción de peso molecular c DNA genómico fragmentado, de bajo peso molecular, obtenido con lisis física fuerte (bead-beating). Debido al procedimiento se obtuvo un “barrido de DNA”, el tamaño de los fragmentos es <2000pb, conforme a las tres bandas inferiores del marcador d DNA genómico fragmentado, de bajo peso molecular, obtenido con lisis física fuerte (bead-beating). Debido al procedimiento se obtuvo un “barrido de DNA”, el tamaño de los fragmentos es <2000pb, conforme a las dos bandas superiores del marcador e DNA genómico de alto peso molecular (bandas superiores), obtenido con lisis química suave . No se puede calcular el tamaño ya que no se incluye marcador. 17 Enzimas de restricción Escoge una o varias respuestas a reconoce una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de DNA pero no lo corta b reconoce una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de DNA y cortarlo en ese punto en concreto (sitio diana) c corte de DNA se realiza a través de a ruptura del enlace fosfoéster en cada hebra de la doble cadena. d reconoce una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de RNA y corta en ese punto en concreto 18 Nomenclatura enzimas de restricción Escoge una o varias respuestas a 1. Nombre científico del microorganismo, las tres primeras letras se escriben en cursiva b 2. La cepa o estirpe si la hubiese c 1. Nombre científico del microorganismo, las dos primeras letras se escriben en cursiva d 3. número romano para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de esa misma especie. e 3. número arábigo para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de esa misma especie. 19 Sistema de restricción-modificación (RM) in vivo Escoge una o varias respuestas a Protección de ataques de DNA exógenos que ingresen en la bacteria, distinguiéndolo del DNA propio. b Metilación a través de la acción de las metiltransferasas, enzimas que transfieren grupos metilo desde S-adenosil-metionina (SAM) a bases específicas. c Metilación a través de la acción de las metiltransferasas, enzimas que transfieren grupos metilo desde S-adenosil-metionina (SAM) a bases no específicas. d Protección de ataques de DNA exógenos que ingresen en la bacteria, aunque no distingue del DNA propio. 20 Restricción por endonucleasas a No confiere inmunidad frente a bacteriófagos b No es por las endonucleasas c inmunidad frente a bacteriófagos que pudieran poner en peligro la individualidad genética 21 Modificación por metilasas a introducción de grupos metilo (CH3-) en determinadas bases dentro de secuencias no específicas del DNA, b deleción de grupos metilo (CH3-) en determinadas bases dentro de secuencias específicas del DNA, c introducción de grupos metilo (CH3-) en determinadas bases dentro de secuencias específicas del DNA, 22 Tipos de enzimas de restricción (tipo 1) Escoge una o varias respuestas a Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restricción (corta) y modificación (metila). b Deja extremos romos. Necesitan de ATPpara moverse en el DNA, ademásdeSAM y Mg ++ como cofactores. c Deja extremos cohesivos. Necesitan de ATPpara moverse en el DNA, ademásdeSAM y Mg ++ como cofactores. d corta al azar en sitios distintos al sitio de reconocimiento, ya sea en dirección 5’ o 3’, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte e corta específicamente en sitios de reconocimiento 23 Tipos de enzimas de restricción (tipo 2) Escoge una o varias respuestas a Solo tienen actividad de restricción b Solo tienen actividad de metilación c El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de él. Sólo requiere Mg 2+ y no ATP d El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de él. Sólo requiere ATP 24 Tipos de enzimas de restricción (tipo 3) Escoge una o varias respuestas a Requieren solo una secuencia de reconocimiento b Enzimas oligoméricas que son de restricción y modificación c Cortan de 25-27 pb del sitio de reconocimiento, dejan extremos cohesivos d Cortan de 20-22 pb del sitio de reconocimiento, dejan extremos cohesivos e Requieren dos secuencias de reconocimiento en orientación opuesta en la misma cadena de DNA. 25 Isoesquizómeros a enzimas aisladas de diferentes organismos que reconocen y rompen la misma secuencia diana b enzimas aisladas de mismos organismos que reconocen pero nprompen la misma secuencia diana c enzimas aisladas de diferentes organismos que reconocen pero no rompen la misma secuencia diana 26 Para el análisis de restricción a Se prepara la mezcla de la digestión-> se incuba->detención->aplicación de gel->electroforesis->teñir gel->tamaño fragmentos deducidos b Se prepara la mezcla de la digestión-> se incuba->detención->aplicación de gel->electroforesis->teñir gel c Se prepara la mezcla de la digestión-> se incuba->detención->aplicación de gel->electroforesis->tamaño fragmentos deducidos 27 Mapa de restricción (físico del DNA) a secuencia no lineal de sitios de restricción separados por distancias definidas b secuencia lineal de sitios de restricción separados por distancias definidas c secuencia lineal de sitios de restricción separados por distancias indefinidas

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¿Cómo se obtiene el material genético puro?

La lisis celular se da con agentes

Procedimientos químicos de la lisis celular

Procedimientos físicos de la lisis celular

Extracción de ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos son

Las proteínas en solución

Las sales en salting out

Los ácidos nucléicos se unen a la sílica en presencia de

Unión selectiva de DNA o RNA a soportes sólidos

La precipitación del DNA/RNA es más eficiente...

Solubilización y evaluación de DNA

Solubilización y evaluación de RNA

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Visualización DNA

Enzimas de restricción

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Sistema de restricción-modificación (RM) in vivo

Restricción por endonucleasas

Modificación por metilasas

Tipos de enzimas de restricción (tipo 1)

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Isoesquizómeros

Para el análisis de restricción

Mapa de restricción (físico del DNA)